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在ELISA試劑盒試驗(yàn)中各種酶標(biāo)儀功能都會(huì)有所不同,所以在運(yùn)用中應(yīng)具體閱讀說明書,再進(jìn)行下一步操作。
自從20世紀(jì)60-70年代面世以來,Elisa法得到*科研工作者的認(rèn)可及推重,在歐美及我國取得很大的推行,尤其是國內(nèi)生化范疇的長足發(fā)展。ELISA試劑盒有著準(zhǔn)確性高、靈敏度高、特異性強(qiáng)等許多的長處,它在檢測抗體、抗原等方面有很好的運(yùn)用,深受廣闊用戶朋友的喜愛。但是,在試驗(yàn)過程中,也需求留意許多問題,特別是顯色、比色問題。
顯色
ELISA試劑盒顯色是ELISA中的終究一步溫育反響,此刻酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)品。反響的溫度和時(shí)刻仍是影響顯色的要素。在一定時(shí)刻內(nèi),陰性孔可堅(jiān)持無色,而陽性孔則隨時(shí)刻的延伸而呈色加強(qiáng)。恰當(dāng)提高溫度有助于加快顯色進(jìn)行。在定量測定中,參加底物后的反響溫度和時(shí)刻應(yīng)按規(guī)則力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行,時(shí)刻一般不需求嚴(yán)格控制,有時(shí)可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色恰當(dāng)縮短或延伸反響時(shí)刻,及時(shí)判別。
OPD(鄰苯二胺)底物顯色一般在室外溫或37℃反響20-30分鐘后即不再加深,再延伸反響時(shí)刻,可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì)自行變色,顯色反響應(yīng)避光進(jìn)行,顯色反響結(jié)束時(shí)參加停止液停止反響。OPD產(chǎn)品用硫酸停止后,顯色由橙轉(zhuǎn)向棕。
TMB(四甲基聯(lián)苯胺)受光照的影響不大,可在室溫中置于操作臺(tái)上,邊反響觀察成果。但為確保試驗(yàn)成果的安穩(wěn)性,宜在規(guī)則的恰當(dāng)時(shí)刻閱讀成果。TMB經(jīng)HRP作用后,約40分鐘顯色達(dá)高峰,隨即逐漸削弱,至2小時(shí)后即可*消退至無色。TMB的停止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反響停止。這類停止劑尚能使藍(lán)色維持較長時(shí)刻(12-24小時(shí))不褪,是目視判別的杰出停止劑。此外,進(jìn)口elisa試劑盒各類酸性停止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成,此刻可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。
比色
比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn),需先將板置于規(guī)范96孔的座架中,才可進(jìn)行比色。在加底物液顯色前,先將軟板邊際剪凈,這樣,此板就可*平妥坐入座架中。
比色時(shí)應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn),測讀底物孔(未經(jīng)任何反響僅加底物液的孔)和空白孔,以記載本次試驗(yàn)的試劑情況。這以后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn),以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,然后進(jìn)行核算。
比色成果的表達(dá)以往通用光密度(oplical density,OD),現(xiàn)按規(guī)則用吸光度(absorbence,A),兩者意義相同。一般的表明辦法是,將吸收波長寫于A字母的右下角,如OPD的吸收波長為492nm,表明辦法為“A492nm”或“OD492nm”。
酶標(biāo)比色儀
酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀,一般指于測讀ELISA成果吸光度的光度計(jì)。針對固相載體方式的不同,各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標(biāo)儀。酶標(biāo)儀的主要功能指標(biāo)有:測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度和可測規(guī)模、線性等等。的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可準(zhǔn)確到0.001,準(zhǔn)確性為±1%,重復(fù)性達(dá)0.5%。舉例說,若某孔測得的A值為1.083,則該孔相對于空氣的實(shí)在A值應(yīng)為1.083± 0.01(1.073~1.093),重復(fù)測定數(shù)次,其A值均應(yīng)1.083±0.05(1.078~1.088)在之間。酶標(biāo)儀的可測規(guī)模視各酶標(biāo)儀的功能而不同。一般的酶標(biāo)儀在0.000~2.000,新型號的酶標(biāo)儀上限拓展達(dá)2.900,乃至更高。超出可測上限的A值常以“*”或“over”或其它符號表明。應(yīng)留意可測規(guī)模與線性規(guī)模的不同,線性規(guī)模常小于可測規(guī)模,比方某一酶標(biāo)儀的可測規(guī)模為0.000~2.900,而其線性規(guī)模僅0.000~2.000,這在定量ELISA中制造規(guī)范曲線時(shí)應(yīng)予留意。
酶標(biāo)儀不該安頓在陽光或強(qiáng)光照射下,操作時(shí)室溫宜在15-30℃,運(yùn)用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘,測讀成果更安穩(wěn)。
ELISA試劑盒測讀A值時(shí),要選用產(chǎn)品的靈敏吸收峰,如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀,即每孔先后測讀兩次,*次在zui適波長(W1),第2次在不靈敏波長(W2),兩次測定間不移動(dòng)ELISA板的方位。例如OPD用492nm為W1,630nm為W2,終究測得的A值為兩者之差(W1-W2)。雙波長式測讀可削減由容器上的劃痕或指印等造成的光攪擾。