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牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。(一)、WHO公布的《用動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求:
1. 牛血清必須來(lái)自有文件證明無(wú)牛海綿狀腦病的牛群或國(guó)家。并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測(cè)系統(tǒng)。
2.有些國(guó)家還要求牛血清來(lái)自未用過(guò)反芻動(dòng)物蛋白飼料的牛群。
3.證明所用牛血清中不含對(duì)所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。
4.血清要通過(guò)濾膜過(guò)濾除菌,保證無(wú)菌。
5.無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒的污染,有些國(guó)家要求無(wú)細(xì)菌噬菌體污染。
6.對(duì)細(xì)胞有良好的支持繁殖作用。
(二)、我國(guó)在對(duì)牛血清的質(zhì)量2000年版《中國(guó)生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》中提出比較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)要求。包括蛋白質(zhì)含量,細(xì)菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素,支持細(xì)胞增殖檢查。
(三)、美國(guó)對(duì)牛血清的質(zhì)量要求:Gibco 和Sigma二家主要的美國(guó)牛血清供應(yīng)商的牛血清都已進(jìn)入到我國(guó)市場(chǎng),他們對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求都極為嚴(yán)格,從血清來(lái)源到產(chǎn)品質(zhì)量都有明確規(guī)定。
1) 血清來(lái)源:可從世界各國(guó)收集胎牛血清,但是必須符合他的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和美國(guó)農(nóng)業(yè)部進(jìn)口要求。地方當(dāng)局還不清楚本地是否有牛海綿狀病毒流行的血清不收集,有說(shuō)明血清質(zhì)量的證明資料:包括收集過(guò)程的全部資料、檢驗(yàn)結(jié)果和交付情況。
2)血清的收集:胎牛血清是心臟穿刺取血,新生牛(10~14天)和小牛(10個(gè)月內(nèi))血清靜脈取血。血清采集條件必須符合工業(yè)生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn):低溫下采集、一次分離、分離后立即混合凍存。符合要求的血清56℃水浴30分鐘滅活。
3)血清的制備:
a. 超低IgG胎牛血清:通過(guò)親和層析工藝去除胎牛血清中的γ球蛋白,使FBS γ球蛋白含量減到zui低,一般IgG≤5ug/ml,生物學(xué)活性不變。
b. 血清透析:用12000~14000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量<0.5mg/ml(用葡萄糖氧化酶/過(guò)氧化酶方法測(cè)定)。
c. γ-射線照射:已經(jīng)證明γ-射線照射可以有效滅活血清中可能污染的病毒、支原體。照射劑量為30~45KG。而且這個(gè)劑量的γ-射線照射不會(huì)改變血清的理化性質(zhì)和對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響。
4)除菌過(guò)濾:經(jīng)過(guò)上述處理的粗制血清再經(jīng)過(guò)一系列除菌濾膜過(guò)濾包括0.2微米(micron)和0.1微米濾膜。FBS要通過(guò)三層0.1微米濾膜,其他血清可通過(guò)0.2微米濾膜。
4.終產(chǎn)品血清質(zhì)量
1)化學(xué)檢定:滲透壓
pH
蛋白含量――電泳法
白蛋白 球蛋白 血紅蛋白
隨著牛年齡增加血清中總蛋白含量相應(yīng)增加,總的血清蛋白含量可以確定產(chǎn)品規(guī)格和年齡。
2) 微生物學(xué)檢查:細(xì)菌、真菌符合USP標(biāo)準(zhǔn)。
支原體:在支原體專業(yè)培養(yǎng)基上培養(yǎng)了3~4周,培養(yǎng)溫度36℃±2℃分別在需氧和厭氧條件下進(jìn)行,有的還需要在支原體瓊脂培養(yǎng)皿上傳4次,Hoechst熒光素DNA染色檢查那些培養(yǎng)法無(wú)法檢出的支原體如豬鼻支原體等。
病毒檢查:
牛蘭舌病毒 Bovin blue tongue
牛腺病毒 Bovine Adenovirus
牛細(xì)小病毒 Bovine Parvovirus
牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus
狂犬病病毒 Rabies
呼腸弧病毒 Reovirus
牛呼吸道合胞病毒 BRSV
副流感病毒Ⅲ型 Parainfluenza
檢查方法:
已證明無(wú)外源因子污染的牛細(xì)胞培養(yǎng)物,在細(xì)胞生長(zhǎng)液中加15%待測(cè)血清,連傳3代共21天。陰性對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)液中加15%已知無(wú)病毒污染的牛血清,與試驗(yàn)組同條件下進(jìn)行。在觀察期內(nèi)注意細(xì)胞形態(tài)變化或細(xì)胞病變。在觀察期內(nèi)第14天待檢樣品和對(duì)照樣品用標(biāo)準(zhǔn)病毒檢測(cè)方法檢查。
如待檢細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)胰酶消化后分種到6個(gè)含蓋玻片的容器內(nèi)。陰性對(duì)照樣品按同樣方法。再將牛腹泄病毒、牛細(xì)小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼腸弧病毒分別加入待檢培養(yǎng)物蓋玻片容器內(nèi)作為陽(yáng)性對(duì)照,再培養(yǎng)7天,用熒光抗體技術(shù)進(jìn)行檢查。
細(xì)胞病變或病毒引起的其他改變通過(guò)蘇木精或伊紅染色進(jìn)行觀察。取另外一個(gè)待檢細(xì)胞培養(yǎng)瓶用人“O”紅細(xì)胞、豚鼠紅細(xì)胞和新鮮雞紅細(xì)胞作血球吸附病毒檢查。試驗(yàn)在2~8℃和20~24℃進(jìn)行。陰性對(duì)照細(xì)胞預(yù)先感染副流感Ⅲ型病毒作為陽(yáng)性對(duì)照。未感染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。
3)內(nèi)毒素檢測(cè)
用鱟試劑檢查。
4)細(xì)菌噬菌體檢查
主要檢查E.Coli(C300 or K-12)噬菌體。
5)激素含量測(cè)定
每批FBS對(duì)某些激素含量都要進(jìn)行測(cè)定,包括:雌二醇、胰島素、孕硐、睪丸素、甲狀腺素等。
6)血紅蛋白檢測(cè)
血紅蛋白與氧合血紅蛋白的比≥70%,血紅蛋白含量≤mg15/dl。
7)細(xì)胞生長(zhǎng)效果測(cè)定
a.細(xì)胞克隆效果測(cè)定
細(xì)胞選擇:Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653
血清濃度與細(xì)胞數(shù):
10%血清/1個(gè)細(xì)胞/孔
4%血清/5個(gè)細(xì)胞/孔
細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640, 96孔培養(yǎng)盤(pán)36℃±2℃,5%二氧化碳培養(yǎng)10~15天。試驗(yàn)中選擇一個(gè)已知參考牛血清作對(duì)照。
克隆效率計(jì)算:
克隆效率=(陽(yáng)性孔平均數(shù)/ 培養(yǎng)孔總數(shù)) X100%
相對(duì)克隆效率=待測(cè)血清克隆效率/參考血清克隆效率
b.貼壁效率試驗(yàn):
用人的傳代細(xì)胞作每批血清的貼壁效率試驗(yàn),A549(人肺癌細(xì)胞)該細(xì)胞可以反應(yīng)出低濃度血清的貼壁變化。采用6孔培養(yǎng)盤(pán)每批血清用兩種濃度和兩種不同的細(xì)胞接種數(shù)即10%血清――100細(xì)胞/孔,4%血清200介細(xì)胞/孔。放36℃±2℃,濕潤(rùn)5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)10~14天,計(jì)算著色細(xì)胞克隆,確定貼壁效率。從這兩種不同血清濃度來(lái)確立實(shí)驗(yàn)血清支持細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的水平,分析兩種試驗(yàn)條件下平均貼壁效率。
貼壁效率(%)=(每孔克隆平均數(shù)/ 每孔活存的培養(yǎng)細(xì)胞平均數(shù)) X100%
相對(duì)貼壁效率=被測(cè)血清貼壁效率/參考血清貼壁效率