口蹄疫酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

1979年Crowther建立了間接夾心ELISA，ELISA試驗是當前應用zui廣的一種免疫測定方法，它是以物理方法將抗體（或抗原）吸附在固相載體上，隨后的一系列免疫學反應和生物化學反應都在此固相載體上進行的免疫酶測定試驗，包括間接法、雙抗體夾心法和競爭法以及近年來發(fā)展的一些改良法。1989年被歐洲FMD防制委員會推薦廣泛使用，成為認可的一種標準化診斷技術。

近年來，ELISA已先后用于FMD病原和血清樣品的診斷并逐步代替補體結合試驗以及中和試驗。這項技術快速、敏感、準確，用滅活的140S制備抗血清或作抗原，可在一般的實驗室操作，還可制成方便的診斷試劑盒。檢測田間樣品時ELISA的敏感性高于補體結合試驗；對于含量較高的樣品，例如新鮮的水皰皮和細胞培養(yǎng)物，可在2—4h內獲得結果，應用預先在實驗室內包被的免疫反應板以及凍干劑，將更便于現場檢測。

2004年G．丸Paiba等應用固相競爭ELISA（SPCE）對綿羊、山羊和豬分別進行了O型FMD血清學抗體檢測，并對效果進行了比較。試驗對2001年英國暴發(fā)FMD其間的267頭綿羊和143頭豬分別進行VNT和SPCE檢測，發(fā)現SPCE較VNT能夠檢測出更多的陽性結果。2001年英國FMD暴發(fā)期間大規(guī)模的血清學調查已充分證實了SPCE方法的靈敏性、可施行性和可重復性。同時田間血清學試驗和實驗室血清學實驗也同樣表明與VNT相比，SPCE方法的敏感性很少因病毒毒株的不同而受影響。

以ELISA為基礎的檢測方法，有許多客觀的*性，敏感性相對較高且適合于大規(guī)模的血清學調查，FMDV非結構蛋白特異性抗體會存在于FMDV持續(xù)感染、短期感染、間歇性感染的豬體，因此FMDV非結構蛋抗體檢測試劑盒已經被研制。我國中國臺灣省已經開始使用NSP抗體檢測ELISA試劑盒。ELISA同時也存在著弊端，2004年Fan Lee等對三種FMDV非結構蛋抗體檢測試劑盒（CHEKIT FMD—3ABC、UBI FMD NS EIA和DVIVRNSPELISA）檢測效果進行了對比研究。這些FMDV非結構蛋白抗體檢測試劑盒被分別應用于健康豬、感染豬和疫苗免疫過的豬，并對試劑盒的特異性與靈敏度進行了檢測。表明特定的三種FMDV非結構蛋白抗體檢測試劑盒都很難將感染病畜與已康復牲畜區(qū)分開，這給檢測工作帶來了較大的困難。

①間接夾心ELISA。間接夾心ELISA是目前OIE FAO（聯合國糧農組織）的FMD—WRI。（世界參考實驗室）確認的檢測FMDV抗原和病毒血清型的方法。該法采用典型的雙抗夾心ELISA操作方式，在ELISA多孔板的不同排部分用型特異兔抗FMD病毒幾個血清型的抗血清（捕獲抗體）包被，于各孔加入被檢樣品懸液，并設強陽性、弱陽性、陰性和空白對照，再加每個FMDV型特異的豚鼠抗血清（檢測抗體），隨后，加酶標記的羊抗豚鼠血清（交聯劑）。每一步都應充分洗滌未結合的試劑。加酶底物后，出現顏色反應時可判為陽性反應，強陽性反應時，肉眼即可判定。也可用酶標讀板儀在適當的波長內讀取結果，在這種情況下，光吸收值比背景大o．1以上即可判為陽性反應，可定出相應的血清型。光吸收值接近o．1時，應重復做或用組織培養(yǎng)物傳代擴增抗原，當出現CPE時，檢測上清液。間接夾心ELISA用于FMD的檢測和定型時，特異性與CFT相同，靈敏度更高，且節(jié)省試劑，重復性好，加之與連接計算機的酶標儀可使操作自動化，判讀結果更準確，在接到待檢樣品后4～5h即可出結果。對于FMD的檢測和定型及制定FMD的防治計劃，有著十分重要的意義。

②液相阻斷夾心ELISA。1986年Hamblin等的液相封閉ELISA（LPBE）問世，該法是將各型已知量的病毒與2倍連續(xù)稀釋的被檢血清混合37~C振蕩lh后轉入4~C濕盒作用，使之充分結合。待檢血清中若含有某型抗體，必然與同型病毒抗原結合。試驗時將上述混合液轉入已用各型相應捕獲抗體包被好的ELISA板中，之后依次加入檢測抗體、交聯劑、底物和終止液，zui后用酶標儀判讀結果。若有未結合的抗原，必然會與捕獲抗體結合。形成的復合物與隨后的檢測抗體作用，zui后按試驗孔呈現顏色與抗原對照（末加血清）孔呈現的顏色相比判定結果。顏色的深淺和抗體的含量呈負相關，即顏色越深，被檢血清中的抗體含量越少。當被檢樣品的OD（光學密度）值小于或等于對照抗原OD值的50％時，該樣品判定為陽性，血清抗體效價以產生相當于50％抗原對照平均值的血清zui終稀釋度表示。其抗體效價1；40相當于VNT效價1：16（VNT檢測標準是抗體效價在1：16以下為陰性）。該方法尤其適合于大批樣品的血清學調查。彌補了VNT的不足，由于VNT方法易產生假陽性反應，需要有一定的技能來產生重復性的結果，因此ELISA方法已經被*大量的實驗室采納作為疫病監(jiān)測方法。對于FMD血清抗體的監(jiān)測具有廣闊的應用前景。