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一、用于免疫的動(dòng)物
作免疫用的動(dòng)物有哺乳類和禽類,主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等,實(shí)驗(yàn)室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動(dòng)物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量,如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清,多用家兔和山羊,因動(dòng)物反應(yīng)良好,而且能夠提供足夠數(shù)量的血清,用于免疫的動(dòng)物應(yīng)適齡,健壯,無感染性疾患,為///雄性,此外還需十分注意動(dòng)物的飼養(yǎng),以消除動(dòng)物的個(gè)體差異以及在免疫過程中死亡的影響。若用兔,用純種新西蘭兔,一組三只,兔的體重以2~3kg為宜。
二、免疫途徑
免疫途徑有多種多樣,如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等,一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射,每點(diǎn)注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性,如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原,一般不宜采用靜脈注射。
三、佐劑
由于不同個(gè)體對(duì)同一抗原的反應(yīng)性不同,而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱,因此常常在注射抗原的同時(shí),加入能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì),以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng),這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。
佐劑除了延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間,增加抗原刺激作用外,更主要的是,它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多,促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用,從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。
常用的佐劑是福氏佐劑(Freund adjuvant),其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份,羊毛脂與石臘油的比例,視需要可調(diào)整為1:2~9(V/V),這是不*福氏佐劑,在每毫升不*佐劑加入1~20mg卡介苗就成為*佐劑。
配制方法:按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi),用超聲波使之混勻,高壓滅菌,置4℃下保存?zhèn)溆?。免疫前取等容積*或不*佐劑與免疫原溶液混合,用振蕩器混勻成乳狀,也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨,均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液(其中加卡介苗3~4mg/ml或不加),加完后再繼續(xù)研磨成乳劑,滴于冰水上5~10min內(nèi)*不擴(kuò)散為止。為避免損失抗原,亦可用一注射器裝抗原液,另一注射器裝佐劑,二者以聚乙烯塑料管連接,然后二者來回反復(fù)抽吸,約數(shù)十分鐘后即能*乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。
四、免疫方法
抗原劑量,劑量為300~500μg,加強(qiáng)免疫的劑量約為劑量為1/4左右。每2~3周加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫時(shí)用不*佐劑,免疫時(shí)皮下注射百日咳疫苗0.5ml,加強(qiáng)免疫時(shí)不必注射百日咳疫苗。
在第2次加強(qiáng)免疫后2周,從耳緣靜脈取2~3ml血,制備血清,檢測(cè)抗體效價(jià)(見后)。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià),需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫,直到滿意時(shí)為止(圖2-3)。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí),即可放血制備抗血清。
五、抗血清的采集與保存
家兔是zui常用以產(chǎn)生抗體的動(dòng)物,因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動(dòng)物以頸靜脈、動(dòng)脈取血,鼠等小動(dòng)物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法,一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血,一是頸動(dòng)脈入血,也可心臟采血。取動(dòng)脈或靜脈放血時(shí),將兔放入一個(gè)特造的木匣或籠內(nèi),耳露于箱(籠)外,也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛,用少許二甲苯涂抹耳廓,30s后,耳血管擴(kuò)張、充血。用手輕拉耳尖,以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片,快速切開動(dòng)脈或靜脈,血液即流出,每次可收集30~40ml 。然后用棉球壓迫止血,凝血后洗去二甲苯。二星期后,可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動(dòng)脈放血時(shí),將兔仰臥,固定于兔臺(tái),剪去頸部的毛,切開皮膚,暴露頸動(dòng)脈,插管,放血。放血過程中要嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行。
收集的血液置于室溫下1h左右,凝固后,置4℃下,過夜(切勿冰凍)析出血清,離心,4000rpm,10min。在無菌條件,吸出血清,分裝(0.05~0.2ml),貯于-40℃以下冰箱,或凍干后貯存于4。C冰箱保存。
六、抗血清質(zhì)量的評(píng)價(jià)
在免疫期間,不僅各個(gè)不同的動(dòng)物,而且同一動(dòng)物在不同的時(shí)間內(nèi)抗血清效價(jià)、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化,因而必須經(jīng)常地采血測(cè)試。只有在對(duì)抗血清的效價(jià)、特異性、親合力等方面作*的評(píng)價(jià)后,才可使用所取得的抗血清。
1、效價(jià)
抗血清的效價(jià),就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價(jià)測(cè)定的方法常用的是放射免疫法,此法對(duì)所有的抗體均適用。某些由大分子(如蛋白類)抗原所產(chǎn)生的抗體,可用雙擴(kuò)散等方法測(cè)定。前者測(cè)定的效價(jià)極為。而后者則粗糙得多。
(1)放射免疫法
以不同稀釋度的抗血清與標(biāo)記抗原混合,孵育24h后,測(cè)定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價(jià)。如某抗血清的結(jié)合率為50%時(shí)的稀釋度為1:15000,則該血清的效價(jià)就是1:15000??寡宓男r(jià),除由抗血清本身的性質(zhì)決定外,還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時(shí)間,所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響,在工作中必須引起注意。
(2)雙向擴(kuò)散法
利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散,兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線,以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。
球脂板的制備:100ml pH 7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi),于水浴中加溫,攪拌,使瓊脂*溶解,趁熱用紗布過濾,待溶液冷卻到65℃左右時(shí),加入疊氮鈉(NaN3),使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上,約3mm厚,待其冷卻,*凝固后,用打孔器打孔。中央孔內(nèi)加適量抗原(容量為50μl),周圍各孔內(nèi)分別加入50μl 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32及不稀釋的抗血清,37℃下孵育24h,觀察有無沉淀線產(chǎn)生,以判斷血清的稀釋度。
2、特異性測(cè)定
抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對(duì)相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識(shí)別能力。特異性好就是抗血清的識(shí)別能力強(qiáng)。通常,特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的。交叉反應(yīng)率低,表示抗血清的特異性好,反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線來判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線,計(jì)算各自的結(jié)合率(B/T或B/B0),求出各自在IC50時(shí)的濃度,按下列公式計(jì)算交叉反應(yīng)率。