人腫瘤壞死因子 α （TNF-α）試劑 盒使用說明書實驗原理 ：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人腫瘤壞死因子 α（TNF-α）水平。用純化的人腫
瘤壞死因子 α（TNF-α）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入腫
瘤壞死因子 α（TNF-α） ，再與 HRP 標記的腫瘤壞死因子 α（TNF-α）抗體結合，形成抗體-
抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成
藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子 α（TNF-α）
呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值） ，通過標準曲線計算樣品中人腫
瘤壞死因子 α（TNF-α）濃度。
試劑盒組成：
試劑盒組成  48 孔配置  96 孔配置  保存
說明書  1 份  1 份 
封板膜  2 片（48）  2 片（96） 
密封袋  1 個  1 個 
酶標包被板  1×48  1×96  2-8℃保存
標準品：450ng/L  0.5ml×1 瓶  0.5ml×1 瓶  2-8℃保存
標準品稀釋液  1.5ml×1 瓶  1.5ml×1 瓶  2-8℃保存
酶標試劑  3 ml×1 瓶  6 ml×1 瓶  2-8℃保存
樣品稀釋液  3 ml×1 瓶  6 ml×1 瓶  2-8℃保存
顯色劑 A 液  3 ml×1 瓶  6 ml×1 瓶  2-8℃保存
顯色劑 B 液  3 ml×1 瓶  6 ml×1 瓶  2-8℃保存
終止液  3ml×1 瓶  6ml×1 瓶  2-8℃保存
濃縮洗滌液  （20ml×20 倍）×1 瓶  （20ml×30 倍）×1 瓶  2-8℃保存
人腫瘤壞死因子 α （TNF-α）試劑 盒使用說明書樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分） 。仔細收集上
清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心
20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分） 。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次
離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分） 。仔細收集上清，保存過程
中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/
分） 。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞
濃度達到 100 萬/ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心 20 分
2
鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分） 。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br />用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4） ，用手工或勻漿器
將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分） 。仔細收集上清。分裝后一份待
檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上
進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
人腫瘤壞死因子 α （TNF-α）試劑 盒使用說明書操作步驟
1.  標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔 10 孔，在*、第二孔中分別加標
準品 100µl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液 50µl，混勻；然后從*孔、第二
孔中各取 100µl 分別加到第三孔和第四孔， 再在第三、 第四孔分別加標準品稀釋液 50µl，
混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50µl 棄掉，再各取 50µl 分別加到第五、第六孔
中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各
取 50µl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50µl，混
勻后從第七、第八孔中分別取 50µl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準
品稀釋液 50µl，混勻后從第九第十孔中各取 50µl 棄掉。 （稀釋后各孔加樣量都為 50µl，
濃度分別為 300 ng/L，200ng/L ，100ng/L，50 ng/L，25 ng/L） 。
2.  加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同） 、待測樣
品孔。 在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40µl， 然后再加待測樣品 10µl（樣
品zui終稀釋度為 5 倍） 。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混
勻。
3.  溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
4.  配液：將 30（48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30（48T 的 20 倍）倍稀釋后備用。
5.  洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此
重復 5 次，拍干。
6.  加酶：每孔加入酶標試劑 50µl，空白孔除外。
7.  溫育：操作同 3。
8.  洗滌：操作同 5。
9.  顯色：每孔先加入顯色劑 A50µl，再加入顯色劑 B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液 50µl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)） 。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值） 。 測定應在加終止
液后 15 分鐘以內(nèi)進行。
注意事項 ：
1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未
用完，板條應裝入密封袋中保存。
2． 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3． 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在 5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值
大于標準品孔*孔的 OD 值） ，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計
算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5） 。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
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6． 底物請避光保存。
7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9． 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
計算 ：
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，
在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的 OD
值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋
倍數(shù)；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值
代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋
倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
試劑盒性能 ：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù) R 值為 0.95 以上。
2.批內(nèi)與批見應分別小于 9%和 11%
檢測范圍 ：
20ng/L -400 ng/L
保存條件及有效期 ：
1.試劑盒保存： ；2-8℃。
2．有效期：6 個月