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    核酸提取、PCR、熒光定量PCR常見問題解答

    發(fā)布時(shí)間: 2010/5/26  點(diǎn)擊次數(shù): 1714次
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    *部分 核酸DNA和RNA提取常見問題分析

    1.       RNAfixer的工作原理?

    浸入組織,抑制RNase的活性。運(yùn)輸方便,是非液氮類的一種樣品儲存液。

    2.       對于內(nèi)源RNase豐富的組織和樣品,如何消除RNase?

    可以在提取時(shí)候多加裂解液,比如4:1等。

    3.       TRIpure and RNApure區(qū)別?

    胍鹽類的裂解液一樣,RNApure附加有離心柱,和漂洗液,是Kit。

    TRIpure只是裂解液。

    4.       凝血的gDNA和RNA的提取與新鮮血的提取不同?

    需加一個(gè)分離柱(separate column)分開凝血。

    5.       microRNA提取和定量?

    過2次離心柱,得到200bp一下的小RNA??梢詼y定OD定量。

    6.       血清,血漿,血液RNA提取的區(qū)別?以及Viral RNA提取的方法?

    液體類樣品RNA提取用TRIpure LS。一般血清、血漿是無細(xì)胞樣品,含游離的RNA,量比較少,建議加Carrier RNA在提取時(shí)候。

    病毒RNA提取加Carrier RNA在提取時(shí)候,BioTeke有專門的病毒RNA提取試劑盒。

    7.       通用植物RNA提取常見問題:蛋白質(zhì)污染?

    DNA污染-DNaseI消化(Kit does not provide it, please get it from other companies.)

    8.       真菌RNA提取

    可用RNApure 或者通用植物RNA提取Kit。

    9.       DNA cleanup from gel and PCR, 區(qū)別?

    膠回收含有一個(gè)溶膠液。多功能膠回收可以用于膠回收和PCR產(chǎn)物回收。

    10.    土壤DNA提取優(yōu)點(diǎn)?

    無需要機(jī)械破碎樣品和過柱的純化方式,減少DNA的鍛煉和得率,達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

     

    第二部分PCR/RT-PCR常見問題解答

    1.     二次PCR無目標(biāo)產(chǎn)物,電泳孔道亮?

    Template稀釋和重新設(shè)計(jì)引物

    2.     microRNA的反轉(zhuǎn)錄問題?

    microRNA反轉(zhuǎn)錄和普通的mRNA的反轉(zhuǎn)錄不一樣。現(xiàn)在常見的microRNA反轉(zhuǎn)錄引物有2種,一個(gè)是step-loop結(jié)構(gòu);另外一種是3末端加polyA后,再用oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄。BioTeke有microRNA提取和2-step real-time PCR Kit。

    3.     cDNA的合成(RT)電泳,以及cDNA第二鏈的合成問題?

    2-5uLcDNA產(chǎn)物電泳有模糊條帶出現(xiàn)。第二鏈合成也有專門的試劑盒。BioTeke現(xiàn)在沒有此類產(chǎn)品。

    4.     Power Mix擴(kuò)增不成功因素?

    產(chǎn)品或者引物或者目的基因的不表達(dá)。

    5.     RT-PCR沒有擴(kuò)增產(chǎn)物?

    可能是引物,模版,產(chǎn)品等。

     

     

    第三部分Real-time qPCR 常見問題分析

    1.     做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)候,可否用2個(gè)不同體系濃度的稀釋分別對于內(nèi)參和目的基因?

    建議用同樣稀釋倍數(shù)做曲線,因?yàn)槟0鍧舛葧?huì)影響擴(kuò)增效率。

    2.     熔解曲線中,Tm不出現(xiàn)在80度左右?

    擴(kuò)增片段100bp左右的,一般應(yīng)該出現(xiàn)在80度左右。如果低于此溫度出現(xiàn),可能是模板降解。

    3.     擴(kuò)增曲線沒有Ct值,僅僅一條斜線?什么原因?

    模板濃度過低或者模板降解。

    4.     如果內(nèi)參和目標(biāo)基因表達(dá)量差別比較大,也就是目的基因的表達(dá)量少,

       Ctcon=15,Cttarget=38,可否應(yīng)用?

    可以用于數(shù)據(jù)分析。因?yàn)楸磉_(dá)量低,從而用過高模板進(jìn)行擴(kuò)增,從而同內(nèi)標(biāo)的模板不同,反而會(huì)增大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的誤差。

    5.     引物濃度可否是50nM,是否太低?

    如果擴(kuò)增曲線和熔解曲線比較好,這個(gè)濃度當(dāng)然可以。如果更低,擴(kuò)增結(jié)果好的情況下,同樣可以運(yùn)用。

    一句話,所有的模板、引物等濃度盡量不要用高的,會(huì)影響擴(kuò)增效率。

    6.     miRNA多個(gè)擴(kuò)增時(shí)候,如果一個(gè)的擴(kuò)增效果比較,其它熔解曲線不止一個(gè)峰,如何解決?

    Primer對于miRNA是專一的。所以重新設(shè)計(jì)引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更換mastermix等。反應(yīng)體系會(huì)影響反應(yīng)產(chǎn)物的。

    7.     相對定量方法,如果用Ct值比較,是各個(gè)樣品平均后在2delt Ct還是分別2 delt Ct在平均比較好?

    相對定量的方法各有優(yōu)缺點(diǎn),主要取決于實(shí)驗(yàn)的目的和材料的準(zhǔn)備。如果是材料群體個(gè)體差異不大,這2種方法基本沒有很大的區(qū)別;如果是個(gè)體差異比較大,建議用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線做。就是分別做內(nèi)參和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別帶入Ct值計(jì)算。

    8.     熔解程序可否不加?

    如果是擴(kuò)增效果好,特異擴(kuò)增,可以不加熔解程序;但建議做好加上。

    9.     擴(kuò)增反應(yīng)體系5uL,擴(kuò)增效率低,什么原因?

    反應(yīng)體系小,各種因素的影響比較大,比如引物濃度、模板濃度及其金屬離子等會(huì)影響擴(kuò)增效率的。

    10.  如何減少非特異性擴(kuò)增的干擾?

    設(shè)計(jì)一對好引物,提高primer的退火溫度,以及設(shè)定吸光溫度。


     

     

     

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