人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF 

本試劑僅供研究使用  標(biāo)本：細(xì)胞培養(yǎng)上清液

一、試 劑 組 成

1、精密度微孔板Microtest Plates 96 wells            2、酶標(biāo)偶合液Enzyme Conjugate   12.0ml

3、標(biāo)準(zhǔn)品Standard 　5 x 1.0ml                     4、呈色劑A、Substrate  A  6.0ml

5、呈色劑B、Substrate B  6.0ml                   6、終止液Stop Solution  6.0ml  

7、濃縮洗滌液（1：20）Rinsing Buffer 60.0ml        8、5倍樣品稀釋液  dilution 15.0m

二、注意事項(xiàng)

1.  此試劑為體外檢測(cè)試劑，效期內(nèi)使用，試劑應(yīng)視為傳染物，不同總批號(hào)的試劑不能混用。

2．  使用前應(yīng)將盒內(nèi)各試劑取出。室溫放置至少30分鐘，

3．  濃縮洗滌液出現(xiàn)結(jié)晶后，請(qǐng)于37℃孵育15分鐘。

4．  濃縮樣品稀釋液出現(xiàn)結(jié)晶后，請(qǐng)于37℃孵育15分鐘

5．  若24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，標(biāo)本可存放于2～8℃。不需及時(shí)實(shí)驗(yàn)，標(biāo)本-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

6．  在沖洗微孔板過程中，務(wù)必反復(fù)清洗干凈，并扣干微孔中的殘余液體，否則將降低度，造成吸光度偏離的假像。

7．  加樣完畢后，應(yīng)注意輕微搖動(dòng)微孔反應(yīng)條，以便使孔中的液體充分混勻。

8．  試劑盒保存于2～8℃，請(qǐng)勿冷凍，有效期請(qǐng)見盒內(nèi)標(biāo)示。

三、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1．使用前應(yīng)將盒內(nèi)各試劑取出，室溫放置至少30分鐘。

2．準(zhǔn)備各種實(shí)驗(yàn)儀器及材料，如微量移液器，吸頭，醫(yī)用蒸餾水等

3．濃縮洗液與醫(yī)用蒸餾水1︰19倍稀釋后成為應(yīng)用洗滌液

4．濃縮樣品稀釋液與醫(yī)用蒸餾水1︰4倍稀釋成應(yīng)用樣品稀釋液

5．用應(yīng)用樣品稀釋液來稀釋樣品，按照1：100的體積比來稀釋樣品如10μl的樣品加入到1ml的應(yīng)用樣品稀釋液中，充分混勻待用。）

四、操 作 步 驟

1．取出酶標(biāo)板，設(shè)空白孔，依照次序?qū)?yīng)分別加入100μl的標(biāo)準(zhǔn)品于空白微孔中（空白孔視為0號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品，用醫(yī)用蒸餾水替代）

2、分別標(biāo)記樣品編號(hào)，加入100μl的稀釋樣品于空白微孔中（不同的樣本采用不同的吸頭）。

3、將酶標(biāo)板置于37℃溫育30分鐘；

4、將酶標(biāo)板板取出，將其中的液體甩去，每個(gè)孔中全部加滿應(yīng)用洗滌液后，立即甩去液體;

5、每個(gè)孔中加滿應(yīng)用洗滌液后，輕微振搖酶標(biāo)板30秒后將孔中的應(yīng)用洗滌液甩去，在吸水紙上將酶標(biāo)板拍干。

6、重復(fù)第5個(gè)步驟5次，在吸水紙上將酶標(biāo)板拍干。

7、在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加入100μl的酶標(biāo)偶合溶液。

8、將96孔板置于37℃溫育30分鐘。

9、將酶標(biāo)板取出，將其中的液體甩去，每個(gè)孔中全部加滿應(yīng)用洗滌液后，立即甩去液體。

10、每個(gè)孔中再次加滿洗滌應(yīng)用液后，室溫輕微振搖酶標(biāo)板30秒后將孔中的應(yīng)用洗滌液甩去，在吸水紙上將酶標(biāo)板拍干。

11、重復(fù)第5個(gè)步驟5次，在吸水紙上將酶標(biāo)板拍干。

12、在每個(gè)孔中加入底物A 50μl后立即加入底物B 50μl。輕輕振蕩混勻。（A液、B液采用不同的吸頭加樣）

13、將酶標(biāo)板置于37℃避光溫育反應(yīng)15分鐘。

14、每個(gè)微孔中加入50μl的終止液，輕輕振蕩混勻。

15、在酶標(biāo)儀上，450nm處測(cè)定OD; 顯色后，15分鐘內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。

16、根據(jù)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本含量

五、結(jié) 果 判 斷

儀器值：于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值。

檢測(cè)值范圍：0 – 32ng/ml                    

    敏感度： 0.2 ng/ml